VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x探究透明質(zhì)酸對(duì)UVB誘導(dǎo)光老化小鼠皮膚屏障作用

2025年9月，佐賀大學(xué)海洋能源研究所化妝品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室Yoshihiro Tokudome研究團(tuán)隊(duì)在期刊《Applied Sciences》發(fā)表了題為《Orally Delivered Hyaluronic Acid Tetrasaccharide Improves Skin Barrier Function in UVB-Irradiated Mice: A Bioactive

Approach for Cosmetic and Nutritional Applications》的文章，其研究?jī)?nèi)容為通過(guò)Caco-2細(xì)胞單層膜通透性測(cè)定評(píng)估透明質(zhì)酸四糖（HA4）的腸道吸收情況，并與高分子量透明質(zhì)酸（HA）進(jìn)行對(duì)比；通過(guò)給UVB照射的小鼠口服HA4或HA，檢測(cè)經(jīng)表皮水分流失（TEWL）、角質(zhì)層含水量（SC）和表皮厚度等指標(biāo)，探究口服HA4對(duì)UVB誘導(dǎo)的皮膚屏障損傷的保護(hù)作用。

摘要

透明質(zhì)酸（HA）存在于多種食物中，關(guān)于其緩解皮膚干燥的功效已有諸多研究。本研究通過(guò)Caco-2細(xì)胞單層膜通透性測(cè)定，比較了透明質(zhì)酸四糖（HA4）與高分子量透明質(zhì)酸的腸道吸收情況，并評(píng)估了口服這兩種物質(zhì)后對(duì)UVB照射小鼠皮膚的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，HA4能透過(guò)Caco-2細(xì)胞單層膜，120分鐘后滲透率達(dá)2.67 μg/cm2，而高分子量HA未表現(xiàn)出通透性。給UVB照射的小鼠口服HA或HA4后，于第26天檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的經(jīng)表皮水分流失（TEWL）較正常組增加17.5±3.1 g/m2/h，而HA4組僅增加8.0±1.7 g/m2/h（與對(duì)照組無(wú)明顯差異）；對(duì)照組的角質(zhì)層含水量下降25.7±1.5任意單位（a.u.），HA4組的下降幅度被抑制，僅為17.5±0.7 a.u.（與對(duì)照組相比p<0.05）。第28天檢測(cè)顯示，對(duì)照組的表皮厚度達(dá)69.5±10.8 μm，HA4組降低至43.5±5.1 μm（與對(duì)照組相比p<0.01）。這些研究結(jié)果表明，口服HA4能被高效吸收，并減輕UVB誘導(dǎo)的皮膚屏障損傷，提示其有望作為改善皮膚干燥的功能性食品成分。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料

透明質(zhì)酸四糖、高分子量透明質(zhì)酸、細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）、漢克平衡鹽溶液（HBSS）、非必需氨基酸、胎牛血清（FBS）等、化學(xué)試劑：乙酸鈉、乙酸銨、乙酸、甲醇、蘇木精-伊紅（HE）染色液、氯仿、乙醇、二甲基甲酰胺、己烷、二甲苯、膽固醇、棕櫚酸、磷酸、五水硫酸銅、10%福爾馬林溶液等、透明質(zhì)酸酶、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：7-8周齡雄性無(wú)毛小鼠（HR-1）

實(shí)驗(yàn)儀器

色譜柱、角質(zhì)層含水量測(cè)定儀、ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)麻醉裝置、冷凍切片機(jī)、熒光顯微鏡

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1. 細(xì)胞培養(yǎng)：將人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2以2×10?個(gè)/皿的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿，使用含20% FBS和0.1 mM非必需氨基酸的MEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO?條件下培養(yǎng)；隨后以6.0×10?個(gè)/cm2的密度接種于Millicell®細(xì)胞培養(yǎng)插入物的頂側(cè)，培養(yǎng)28天制備Caco-2細(xì)胞單層膜，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基。

2. 細(xì)胞通透性測(cè)試：選用55-60代的Caco-2細(xì)胞單層膜，通過(guò)Millicell® ERS-2伏安計(jì)測(cè)定跨上皮電阻（TEER），選取TEER值高于250 Ω·cm2的單層膜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；用HBSS（pH6.0）沖洗單層膜后，在基底側(cè)加入HBSS，頂側(cè)加入5 mg/mL的HA或HA4溶液（HBSS pH6.0配制）；分別在30、60、90、120分鐘時(shí)從基底側(cè)取樣200 μL，并補(bǔ)充等量新鮮HBSS，實(shí)驗(yàn)前后均檢測(cè)TEER值以確認(rèn)單層膜完整性。

3. HA和HA4的定量測(cè)定：用透明質(zhì)酸酶（40 U/mL，乙酸鈉緩沖液pH5.0配制）在37℃下將透過(guò)單層膜的HA分解為HA4，持續(xù)24小時(shí)；采用LC-MS/MS系統(tǒng)定量測(cè)定HA4，色譜柱為InertSustain® C18，流動(dòng)相為含20%甲醇的10 mM乙酸銨溶液，流速200 μL/min，以負(fù)離子模式檢測(cè)（產(chǎn)物/前體離子對(duì)192.9/775.2）；通過(guò)分解不同濃度HA溶液制備校準(zhǔn)曲線。

4. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)小鼠自由攝食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境為12小時(shí)光暗循環(huán)、恒溫（25±2℃）、恒濕（50±10%）；將0.1 mg/mL的HA和HA4水溶液以10 mL/kg的劑量每日給小鼠口服，持續(xù)28天，對(duì)照組口服等量純凈水；第1-4周的照射劑量分別為30、60、90、120 mJ/cm2/天，每周3次；每周5次使用ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x檢測(cè)小鼠的TEWL數(shù)據(jù)。

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量?jī)x

HA4 口服給藥聯(lián)合中波紫外線照射后小鼠的經(jīng)表皮失水量變化

5. 組織學(xué)分析：將皮膚組織包埋于OCT復(fù)合物，使用LEICA CM3050S冷凍切片機(jī)制備5 μm厚的冷凍切片（內(nèi)部溫度和底座溫度均為-25℃）；經(jīng)10%福爾馬林固定、HE染色后，用BZ-710倒置熒光顯微鏡觀察，每個(gè)組織切片選取20個(gè)點(diǎn)測(cè)量表皮厚度并取平均值。

6. 統(tǒng)計(jì)分析：采用JMP® v.13.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)Tukey事后多重比較檢驗(yàn)計(jì)算p值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

1. 腸道吸收方面：HA4能以完整形式透過(guò)Caco-2細(xì)胞單層膜，120分鐘后滲透率達(dá)2.67 μg/cm2，而高分子量HA無(wú)法透過(guò)該單層膜，提示HA4的腸道吸收效率高于高分子量HA。

2. 皮膚屏障保護(hù)方面：口服HA4能減輕UVB照射引起的小鼠角質(zhì)層含水量下降，抑制經(jīng)表皮水分流失的增加，且效果優(yōu)于高分子量HA；同時(shí)能有效抑制UVB誘導(dǎo)的表皮增厚，改善皮膚形態(tài)異常。

應(yīng)用前景：HA4口服后可高效吸收并發(fā)揮皮膚保護(hù)作用，有望作為功能性食品成分，用于改善皮膚干燥和皺紋問(wèn)題，為化妝品和營(yíng)養(yǎng)領(lǐng)域提供新的生物活性方案。

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